FASTQ 格式：原始测序观测的标准化编码

快速概览

FASTQ 是生物信息学分析流程的起点，承载测序仪输出的原始 reads 及其质量分数。理解其结构、质量编码体系和变体，是质控、比对和定量分析的前提。

FASTQ 四行结构：标识符、序列、分隔符、质量分数
Phred 质量分数将 ASCII 字符映射为碱基错误概率
不同测序平台（Illumina、PacBio、ONT）的 FASTQ 变体与质量编码体系
FASTQ 不保存任何参考坐标信息——比对后才建立位置关系

是什么

FASTQ 格式编码的是原始测序观测（raw sequencing reads）——测序仪直接输出的碱基序列及其对应的质量分数（quality scores）。这是分析流程的起点，承载实验观测的原始证据。

每条测序 read 在 FASTQ 中由四行组成：

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTC
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>

| 行号 | 内容 | 说明 | |------|------|------| | 1 | 标识符行（@ 开头） | read ID、仪器信息、barcode/UMI（如有） | | 2 | 碱基序列 | 测序仪调用的碱基（A/C/G/T/N） | | 3 | 分隔符（+ 开头） | 可重复标识符，或留空 | | 4 | 质量分数 | ASCII 编码的 Phred 质量值，与第 2 行等长 |

为什么重要

FASTQ 是整个分析链条的证据源头。所有下游分析——比对、变异检测、表达定量——的可靠性都取决于 FASTQ 中保存的原始观测质量。

理解 FASTQ 的关键在于认识到：

它只包含"读到了什么"，不包含"它在哪里"——位置信息需要比对后才能获得
质量分数是误差模型的核心——后续算法（如变异检测器）依赖质量值计算置信度
格式变体反映测序技术差异——Illumina 短读长与 PacBio/ONT 长读长的 FASTQ 有不同的特征

Phred 质量分数体系

数学定义

Phred 质量分数 $Q$ 与碱基错误概率 $P$ 的关系为：

$Q = -10 \log_{10}(P)$

反过来，错误概率为：

$P = 10^{-Q/10}$

常用质量值对照

| Phred Q | 错误概率 P | 碱基正确率 | 说明 | |---------|-----------|-----------|------| | 10 | 0.1 | 90% | 低质量阈值 | | 20 | 0.01 | 99% | 常用质控阈值 | | 30 | 0.001 | 99.9% | Illumina 高质量 reads | | 40 | 0.0001 | 99.99% | 极高置信度 |

ASCII 编码

质量分数通过 ASCII 字符编码存储。历史上存在三种编码体系：

| 编码体系 | ASCII 范围 | Phred 范围 | 使用场景 | |---------|-----------|-----------|---------| | Sanger / Phred+33 | ! (33) ~ ~ (126) | 0 ~ 93 | 现代 Illumina（1.8+）、PacBio、ONT | | Illumina 1.3+ / Phred+64 | @ (64) ~ ~ (126) | 0 ~ 62 | 旧版 Illumina（1.3-1.7） | | Solexa | ; (59) ~ ~ (126) | -5 ~ 62 | 极早期 Solexa 仪器 |

关键注意：现代测序数据几乎统一使用 Phred+33 编码。如果看到质量字符从 ! 开始，通常是 Phred+33；如果从 @ 开始，可能是 Phred+64。

质量值的生物学意义

质量分数不仅仅是技术指标，它直接影响下游分析：

低质量碱基可能导致错误的变异调用（false positive SNPs）
质量分布偏移可能指示测序周期末端的信号衰减
质量修剪（quality trimming） 是质控流程的标准步骤，去除低质量末端

FASTQ 标识符的结构

现代 FASTQ 标识符行包含丰富的元数据。以 Illumina 为例：

@M00123:45:000000000-A1B2C:1:1101:12345:6789 1:N:0:ATCACG

| 字段 | 说明 | |------|------| | M00123:45 | 仪器 ID 和运行 ID | | 000000000-A1B2C | Flowcell ID | | 1:1101 | 流道（lane）和瓦片（tile） | | 12345:6789 | 簇的 x/y 坐标 | | 1 | read 编号（1 或 2，paired-end 时区分） | | N | 是否过滤（Y = 未通过，N = 通过） | | 0 | 控制位 | | ATCACG | index/barcode 序列 |

PacBio 和 Oxford Nanopore 的标识符格式不同，通常包含 molecule ID、zmw 坐标等信息。

Paired-end 与单端

单端测序（Single-end）

每个 DNA 片段产生一条 read，存储在一个 FASTQ 文件中。

双端测序（Paired-end）

每个 DNA 片段从两端分别测序，产生 read1 和 read2：

sample_R1.fastq.gz  ← read 1 序列
sample_R2.fastq.gz  ← read 2 序列

两个文件中的 reads 按顺序一一对应（第 n 行的 read1 与第 n 行的 read2 来自同一个 DNA 片段）。

关键约束：paired-end 分析要求两个 FASTQ 文件的 read 顺序严格同步。如果文件被打乱，配对关系将丢失。

FASTQ 与其他格式的关系

| 对比 | FASTQ | 对比格式 | |------|-------|---------| | FASTA | 包含序列 + 质量分数，是原始观测 | 只包含序列，常作为参考序列 | | SAM/BAM | 尚未建立参考坐标关系 | 比对后获得位置、CIGAR、MAPQ | | VCF | 只包含原始 reads，无变异推断 | 基于比对证据的变异调用结果 |

核心原则：FASTQ 是分析流程的输入层，不保存任何比对、注释或变异信息。

与真实工具或流程的连接

常见概念误区

本章小结

FASTQ 是分析流程的证据源头，保存原始 reads 和质量分数
Phred 质量分数通过 ASCII 编码，现代数据统一使用 Phred+33
FASTQ 不保存参考坐标——比对后才建立位置关系
质控和质量修剪是 FASTQ 进入下游分析前的标准步骤